明日叶根黄酮与DNA相互作用的光谱研究
研究场所：海南师范大学，海口市热带特色药食同源植物研究与开发重点实验室 研究地点：海南 海口
摘 要
研究明日叶根的黄酮类化合物的提取，分离以及与 DNA 相互作用的光谱研究。在 pH 为 7.2 的 Tris-HCl 缓冲溶液体系中，应用荧光光谱法和紫外光谱技术研究明日叶根黄酮和 DNA 复合物分子间的相互作用；利用 Stem-Volmer方程探讨明日叶根黄酮对 DNA 的荧光猝灭机制，计算出热力学参数。结果表明：DNA 与明日叶根黄酮之间存在较强的相互作用，25 ℃时结合常数为 5.35 × 105 L/mol，热力学参数 r Ssm= 97.5 J/Kmol，r Gsm= -3.32 × 104 J/mol，r Hsm= -4.147 ×103 J/mol 表明黄酮分子与 DNA 作用以氢键和范德华力为主，通过嵌插结合的方式。
关键词：明日叶；黄酮；DNA；荧光猝灭；机制
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Spectrometry on Interaction between Angelica keiskei Roots Flavone and DNA
Hainan Normal University，Haikou Key Laboratory of Topical & Special Medicine and Edible Plant in Research and Development，Haikou 571127，Hainan，China
Abstract（英文摘要）
Flavone was extracted and separated from Angelica keiskei root alcohol extracts and the interaction mechanism between angelica keiskei roots flavone and DNA was studied using UV spectrometry and fluorescence spectrometry. The quenching mechanism of fluorescence and the thermodynamic parameters of the complex was discussed .The results showed that there were strong interaction between angelica keiskei roots flavone and DNA.
The binding constant was 5.35×105L/mol at 298 Kand the thermodynamic parameters of the complex were △r Ssm=97.5 J/Kmol， △r Gsm= -3.32 × 104 J/mol， △r Hsm= -4.147 × 103 J/mol. The interacting forces were mainly hydrop Hobic interactions and hydrogen bonds between flavone and DNA.This study could provide important information for further study about the p Harmacological activity of angelica keiskei roots flavone.
Key words：Angelica keiskei； flavone； DNA； fluorescence quenching； mechanism
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明日叶 Angelica keiskei 别名明日草[1]、八丈草，含有人体所必需的各种维生素、矿物质，其根茎中含有丰富的天然黄酮（flavonoid）和香豆素（Coumarin），这些物质具有抗菌、抗癌作用。
通常认为，脱氧核糖核酸（DNA）是重要的遗传物质，与药物分子的相互作用会影响到 DNA 转录和翻译[2]，从而引起活细胞的物理化学性质和生理功能的改变，起到抗癌[3]或者药效作用，因此众多学者开始致力于研究药物分子与 DNA 的相互作用。
目前，通常对药物分子通过沟槽或是嵌插结合在核酸的螺旋沟或碱基中，诱发许多生物效应，阻碍核酸信息的正常表达，特别是嵌插作用，或直接抑制 DNA 的复制和转录功能；或在经过进一步活化后，使 DNA 断裂受损而影响其功能。
研究药物小分子与DNA 的相互作用机制，有利于了解药物的作用机理，进而为新药设计和筛选提供有价值的信息[4]。
有关明日叶根的黄酮类化合物与 DNA 相互作用的光谱分析尚未见报道，本文通过对明日叶根某些黄酮类化合物与 DNA 相互作用机制的研究，旨在为明日叶药理活性的研究和利用提供有价值的信息，同时对高效、低毒天然药物的设计与开发具有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
高效液相色谱仪：大连依利特分析仪器有限公司；RF-5301 荧光分光光度仪：日本岛津公司；明日叶根：青岛；鲱鱼：DNA Sigma 公司；薄层色谱板 Kieselgel 60 F254：Merck 公司；其余试剂均为分析纯。
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1.2 明日叶根黄酮的分离与纯化
取明日叶根洗净、粉碎，过 100 目筛，分别称取100 g 粉末按料液比 1 ∶ 10 的比例加入 75 %的乙醇，浸泡 24 h 后过滤，滤渣用 75 %的乙醇重新处理三次，合并滤液，得到明日叶根黄酮初提液。用石油醚浸泡12 h，以除去脂溶性物质，过滤，得到下层黄色液体，减压浓缩，得到黄色膏状提取物，低温保存。
将明日叶根黄酮膏状提取物用层析硅胶（100 目）拌样，经正相硅胶柱层析分离，以 90 %甲醇进行梯度洗脱，每 10 min 接一次样，后通过薄层层析色谱追踪，合并斑点相同的组分，得到（A-G）7 个馏分。
将 G 馏分浓缩用层析硅胶（100 目）拌样，经硅胶柱层析用正己烷-乙酸乙酯 2 ∶ 1 梯度洗脱，每 5 min 接一次样，经薄层层析色谱追踪后合并斑点相同组分得到（G1-7）7 个馏分，取 G7 馏分，得到黄酮提取物。
1.3 明日叶根黄酮提取物与 DNA 相互作用的光谱研究
1.3.1 DNA 猝灭实验
在 4 个 10 m L 容量瓶中，依次分别加入固定量明日叶根黄酮溶液和不同量的 DNA 溶液，随后均加入固定量的 p H=7.2 的 Tris-HCl 缓冲溶液并用二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，在荧光仪上进行荧光光谱和吸收光谱的测定。荧光激发波长为 368 nm，发射波长为450 nm，狭缝宽均为 5 nm。
1.3.2 UV-vis 光谱
在 4 个 10 m L 的容量瓶中，分别加入固定量的Tris-HCl 缓冲溶液和固定量的 DNA 溶液，随后分别加入不同量的明日叶根黄酮溶液并用二次蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置 10 min 后进行紫外光谱测定。
2 结果
2.1 明日叶根黄酮提取物对 DNA 紫外吸收光谱的影响
一般而言，化合物与 DNA 如果存在相互作用就必然会在吸收光谱中有所反映，因为具有双螺旋结构的 DNA 分子中由于含有芳香性碱基与磷酸生色团而在 260 nm 左右存在一强烈的吸收。DNA 的碱基是许多药物与 DNA 作用的位点，药物与 DNA 结合将引起DNA 特征吸收峰的变化，见图 1。
1，2，3，4表示黄酮浓度分别为0，0.8，1.6，2.4（10-5mol/L）
图1 不同明日叶根黄酮浓度下的紫外吸收光谱
Fig.1 The ultraviolet absorption spectrum of interaction between different concentrations of Angelica keiskei roots flavone
从图 1 可以发现，随着溶液中明日叶根黄酮浓度的逐渐增大，DNA 的紫外吸收光谱出现了增色效应和红移现象，这种增色效应是由于嵌插剂嵌入核酸双螺旋结构中，并且嵌入剂可在两个碱基对之间滑动，从而降低了与核酸的超螺旋程度密切相关的链环数，使得超螺旋的紧密结构变成较为松驰的状态[5]。Long 理论认为红移现象是小分子与 DNA 发生嵌插作用的标志，由此可以初步推断明日叶根黄酮分子可能嵌插进DNA 的碱基对中，结合到 DNA 的亲核位点，引起了紫外吸收官能团的改变[6-7]。
2.2 DNA 存在下明日叶根黄酮提取物的荧光光谱
图2 为DNA 存在下明日叶根黄酮的荧光发射光谱。
1，2，3，4表示黄酮浓度分别为0，0.534，1.068，1.602（2.3×10-5 mol/L）
图2 DNA 存在下明日叶根黄酮提取物的荧光光谱
Fig. 2 Fluorescence spectrum of interaction between different concentrations of Angelica keiskei roots flavone
从图2 中可以看出，明日叶根黄酮在450 nm（λex=368 nm）处有一最大发射峰。DNA 的存在可使明日叶根黄酮最大荧光发射峰的荧光强度发生猝灭。当DNA 浓度逐渐增大时，猝灭程度逐渐增强。表明DNA和明日叶根黄酮可能形成了复合物。
2.3 猝灭机制
由荧光猝灭的Stem-Volmer 方程：
F0/F = 1 + KSVC （1）
式中：F0 为未加入猝灭剂时荧光物质的荧光强度；F 为猝灭剂浓度等于C 时荧光物质的荧光强度；KSV 为Stem-Volmer 猝灭常数[8-10]，（L/mol）。
求出在298 K 时，DNA 对明日叶根黄酮的Stem-Volmer 猝灭常数KSV 为0.94×103 L/mol，同时温度升高，其KSV 为0.93×103 L/mol。如果对动态猝灭来说，其猝灭常数随温度升高将会升高，因此上述结果表明DNA 对明日叶根黄酮的荧光猝灭不是由于分子间动态碰撞，而是静态猝灭。
2.4 DNA 与明日叶根黄酮提取物二元络合物的组成及其结合常数
静态荧光强度与猝灭剂的关系[7]，如公式（2）所示。
lg[(F0 – F)/F] = lgK + nlg[C] （2）
式中：F0 与F 分别代表未加入和加入DNA 时的荧光强度；K 为明日叶根黄酮与猝灭剂之间的结合常数，（L/mol）；C 为猝灭剂DNA 的浓度；n 为结合位点数。
由式（2）分别作出明日叶根黄酮-DNA 体系的关系图（图3）。
图3 25 ℃下明日叶根黄酮-DNA 体系的F0/F-C 工作曲线
Fig.3 F0/F-C working curve in the different concentrations of Angelica keiskei Roots flavone and DNA system at 25 ℃
注：黄酮浓度为2.3×10-5 mol/L。
通过斜率和外推截距可以求出明日叶根黄酮与猝灭剂之间的结合常数。25 ℃时明日叶根黄酮与DNA之间的结合常数为5.35×105 L/mol，经典插入方式是与结合DNA 的溴化乙锭的结合常数为4.9×105，这说明明日叶根黄酮提取物与DNA 主要以插入方式。
![图4 303 K 和298 K 下明日叶根黄酮-DNA 体系的lg[（F0-F）/F]-lg[C]工作曲线](https://www.mingriye.com.cn/wp-content/uploads/2016/12/mingriye-huangtong-dna-4.png)
F0与F 分别代表未加入和加入DNA 时的荧光强度；C 为猝灭剂
DNA 的浓度，10-5 mol/L。
图4 303 K 和298 K 下明日叶根黄酮-DNA 体系的lg[（F0-F）/F]-lg[C]工作曲线
Fig.4 lg（F0 – F）/F – lg [C] working curve in the system of Angelica keiskei roots flavone and DNA at 303 K and 298 K
小分子和大分子之间作用力包括氢键，范德华力，静电引力和疏水作用，热力学参数焓变△rHsm，熵变△rSsm 和自由能△rGsm 决定热力学模式，热力学有关参数计算公式[11]如下：
△rHsm = [2.303RT1T2/( T2 – T1)] [log (K2/K1)]
△rGsm = -2.303RT log K = △rHsm – T△rSsm
表1 可以知道热力学参数，△rHsm，熵变表示分子之间的氢键和范德华力作用强弱，△r Ssm 表示分子之间的疏水作用，△rGsm 越负说明反应自发进行。
| 表1 结合反应的热力学参数
Table 1 Thermodynamics parameters in binding reaction |
|||
| 温度/K | rHsm /（J/mol） | rSsm /（J/Kmol） | rGsm /（J/mol） |
| 298 | -4.147×103 | 97.5 | -3.32×104 |
| 303 | -4.147×103 | 97.5 | -3.26×104 |
表1 说明，明日叶根黄酮与DNA 结合作用力以分子之间的氢键和范德华力为主。
3 结论
用荧光法[11]和紫外吸收光谱法研究了DNA 与明日叶根黄酮的相互作用，明日叶根黄酮在450 nm（λex=368 nm）处有一最大发射峰。DNA 的存在可使明日叶根黄酮最大荧光发射峰的荧光强度发生猝灭。当DNA浓度逐渐增大时，猝灭程度逐渐增强。
DNA 与明日叶根黄酮之间存在较强的相互作用，25 ℃时结合常数为5.35×105 L/mol 结合方式是明日叶根黄酮通过插入方式与DNA 结合，他们之间主要靠分
子之间的氢键和范德华力。
参考文献
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*基金项目：海口市应用技术研究与开发项目 （2014-90）；海南省高等学校科学研究基金项目 （Hjkj2012-22）；海南省省级创新训练项目（2013116580）；海南省高等学校优秀中青年骨干教师培育项目
*作者简介：刘红（1967—），女（汉），教授，硕士生导师，博士，主要研究领域：天然产物分离新技术。
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