明日叶查尔酮对小鼠肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响

摘  要

目的：

研究明日叶查尔酮（Ashitabechalcone，AC）对小鼠H22肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响。

方法：

将50只荷H22肝癌小鼠随机分为AC不同剂量实验组（5、20、40mg/kg），阴性对照组和环磷酞胺（cytoxan，CTX）阳性对照组，共5组，每组10只。AC实验组小鼠每天分别按不同的剂量灌胃，阴性对照组小鼠给予生理盐水灌胃，CTX组隔天腹腔注射CTX20mg/kg，10d后处死小鼠，取瘤组织测定瘤质量、抑瘤率，并采用免疫组化法检测各组小鼠肿瘤细胞Caspase-3和Bax蛋白的表达，用MTT法检测各组小鼠肿瘤细胞增殖活性。

结果：

阴性对照组小鼠肿瘤细胞Caspase-3和Bax阳性细胞表达率分别为5.00%和4.68%，AC40mg/kg剂量组分别为38.52%和35.76%，均高于阴性对照组（P<0.05）；阴性对照组肝癌细胞增殖活性为1.135±0.032，AC40mg/kg剂量组为0.716±0.018，低于阴性对照组（P<0.05）。AC20、40mg/kg剂量组平均瘤质量均明显低于阴性对照组（P<0.05）。

结论：

明日叶查尔酮可上调Caspase-3和Bax蛋白的表达且具有抑制肿瘤细胞增殖作用。

关键词：

明日叶查尔酮，肝癌，Caspase-3，Bax

研究地点：

青岛大学医学院

 

明日叶（Ashitaba）是一种野生芹科植物，原产于日本八丈诸岛，因其生命力顽强，今日摘叶明日可发新芽，故称明日叶。据报道，该植物具有提高机体免疫力、改善睡眠、延缓衰老等多重功效。

有研究证明，明日叶的主要效应成分查尔酮（chalcone），在抗肿瘤、抗氧化等方面作用显著。细胞凋亡与肿瘤的发生发展有非常密切的关系，细胞凋亡减少是肿瘤发生发展的重要因素。Caspase-3是凋亡执行的重要效应分子，Bax是重要的促凋亡蛋白，二者在细胞凋亡的过程中起着关键作用。但目前尚未见明日叶查尔酮对肿瘤细胞Caspase-3和Bax蛋白表达影响方面的研究报道。

本实验采用H22肝癌荷瘤小鼠，通过饲以不同剂量的明日叶查尔酮（Ashitabachalcone，AC），用免疫组化法检测小鼠肿瘤细胞Caspase-3和Bax的表达情况，用MTT法检测小鼠肿瘤细胞增殖活性等，观察AC的抗肿瘤作用。

1材料与方法

1.1动物和材料

H22肝癌荷瘤种鼠由山东省实验动物中心提供。清洁级健康昆明小鼠50只（雌雄各半），由山东鲁抗医药实验中心提供，6~8周龄，体质量18~20g。小鼠实验前于本实验室适应性喂养7天。明日叶查尔酮由本实验室制备，经紫外分光光度法测定其纯度>90%。查尔酮标准品购于美国Sigma公司，纯度＞99%。RPMI1640培养基、胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购自美国Gibc。公司；环磷酞胺（cytoxan，CTX）购于江苏恒瑞医药股份有限公司；Caspase-3，Bax、一抗、二抗和即用型SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。5%二氧化碳培养箱，日本三洋电器有限公司产品；TDL-5离心机，上海安亭科学仪器厂产品；瑞典产R。sysAnth。s2010型双波长酶标仪；日本产。lympusXDS-1B型倒置显微镜；电子天平，上海天平仪器厂产品。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理

无菌抽取H22肝癌小鼠腹水，镜下调节肿瘤细胞密度至1×10⁷/ml，制成细胞悬液于小鼠右前肢腋窝处皮下接种，每只0.2ml。肿瘤细胞接种后次日，将50只小鼠随机分为阴性对照组、环磷酞胺组和AC不同剂量实验组（5、20、40mg/kg），每组10只，雌雄各半。3个AC实验组分别经口灌胃给予不同浓度的AC，连续10天。阴性对照组同法给予生理盐水，环磷酞胺组隔日腹腔注射CTX1次（20mg/kg）。于第11天颈椎脱臼处死小鼠，取瘤组织待检。

1.2.2瘤细胞中Caspase-3和Bax蛋白表达的检测

采用SABC免疫组化法，按检测试剂盒说明操作。将瘤组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，3%H₂0₂消除内源性过氧化物酶，微波修复抗原。按1：50浓度滴加一抗，4℃过夜，滴加二抗，DAB显色，脱水，透明和封片。显微镜下观察Caspase-3和Bax蛋白的表达水平。Caspase-3阳性表达细胞为细胞胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒。Bax主要在胞浆表达，呈现棕黄色或褐色颗粒的细胞为阳性表达细胞。每只动物观察500个细胞，计数其中有阳性表达的细胞。按下式计算阳性表达率：

阳性表达率=〔阳性细胞数叶数细胞总数）x100%

1.2.3瘤细胞增殖活性测定

将瘤组织剪碎研磨，经过滤、离心后制成瘤细胞悬液。调节细胞密度为1×10⁶/ml，接种于96孔培养板，每孔100ul，置于5%二氧化碳培养箱中37℃培养16h。用MTT法测定各孔吸光度，各组肿瘤细胞增殖活性用平均吸光度D（490）值表示，并按下列公式计算各组小鼠肝癌细胞增殖活性的抑制率：

抑制率=〔阴性对照组D（490）值－实验组D（490）值〕/阴性对照组D（490）值x100%

1.2.4瘤质量和抑瘤率

用电子天平称量每只动物瘤质量，计算各组平均瘤质量，并按下列公式计算抑瘤率：

抑瘤率＝（阴性对照组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）/阴性对照组平均瘤质量x100%

1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计软件处理数据，计数资料采用了检验，计量资料用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

2结果

2.1Caspase-3和Bax蛋白表达

结果见表1。

阴性对照组阳性表达的细胞数少且颜色浅淡，呈弱表达（图1A），阳性表达率为5.00%。AC40mg/kg剂量组Caspase-3阳性表达细胞数多且颜色较深，呈强表达（图1B），其阳性表达率为38.52%，明显高于阴性对照组（P<0.05）。

阴性对照组Bax阳性表达的细胞少，染色浅（图2A）。AC40mg/kg组较阴性对照组的阳性表达细胞数多，且染色较深（图2B）。AC40mg/kg组阳性细胞表达率为35.76%，明显高于阴性对照组（4.68%）（P<0.05）。

2.2肿瘤细胞增殖活性

各组细胞增殖活性测定结果见表2。AC20、40mg/kg剂量组肿瘤细胞增殖活性分别为0.716±0.018和0.834±0.027，均较阴性对照组显著降低（P<0.05）。

2.3平均瘤质量和抑瘤率

结果见表3。AC20、40mg/kg剂量组平均瘤质量均显著低于阴性对照组（P<0.05）。

3讨论

明日叶查尔酮属黄酮类化合物，是明日叶的主要功效成分，其化学结构为1,3-二苯基丙烯酮，是植物体内合成黄酮的前体，以它为母体的天然化合物广泛存在于植物界中。有研究证明，从甘草中提取的查尔酮具有抗肿瘤、抗氧化等功效，本实验探讨了从明日叶中提取的查尔酮对小鼠肝癌细胞的影响。

Caspase为天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白水解酶，是一类可介导细胞凋亡的蛋白水解酶。Caspase的活性位点均包含半胧氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肤键，从而造成细胞凋亡。

Caspase-3是Caspase家族中重要的公共凋亡效应因子，其活化在细胞凋亡信号转导过程中起核心作用，是细胞凋亡过程中激活的关键蛋白激酶和主要效应因子。大多数触发细胞凋亡的因素，均需通过Caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡。当Caspase-3表达增多时，细胞凋亡加速。

本实验结果显示，AC40、20mg/kg剂量AC组瘤细胞Caspase-3的阳性表达率均高于阴性对照组，说明AC具有引发肿瘤细胞Caspase-3蛋白表达，促进瘤细胞凋亡的作用。该结果与文献中报道的查尔酮具有抗肿瘤作用的结论相一致。

Bax是Bcl-2家族中重要一员，起促凋亡作用。Bax蛋白被激活后将会易位至线粒体外膜，发生寡聚体化，线粒体通透性转变通道开放，线粒体内的细胞色素C进入细胞质，启动线粒体依赖性的凋亡通路，使细胞发生凋亡。当Bax蛋白表达增多时，细胞凋亡加速。

本实验结果中阴性对照组Bax蛋白的阳性表达率低于AC40、20mg/kg剂量组，说明AC可引发肿瘤细胞中Bax蛋白的表达，促进肿瘤细胞凋亡。该结果与前述Caspase-3蛋白表达相吻合。

细胞增殖活性是反映细胞生理状态的基础性指标。本实验结果显示，AC20、40mg/kg剂量组肿瘤细胞增殖活性明显低于阴性对照组，说明AC对H22肝癌细胞增殖有一定抑制作用。

瘤质量是表示肿瘤发展状态的重要指标。结果显示，AC20、40mg/kg剂量组平均瘤质量均低于阴性对照组，提示AC具有抑制肝癌细胞生长的作用。两项结果均与上述Caspase-3和Bax的测定结果相吻合。

综上，明日叶查尔酮能降低小鼠H22肝癌细胞的增殖活性，提高Casepase-3和Bax蛋白表达水平，具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用。