明日叶黄酮类化合物清除羟基自由基活性研究

研究地点：

• 贵阳护理职业学院，贵州贵阳 550081
• 上海交通大学农业与生物学院陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240

摘     要

目的及方法：

为了研究明日叶黄酮类化合物对羟基自由基的清除作用，以明日叶（主要取叶片）为原料，用体积分数为65%乙醇提取明日叶总黄酮，测定其总黄酮含量。通过Fenton反应体系产生羟基自由基，利用明日叶提取液中的功能成分黄酮类化合物对羟基自由基的清除作用进行研究。

结果表明：

明日叶提取物总黄酮质量分数为10.18%，且黄酮类化合物对羟基自由基有较强清除效力，当提取物总黄酮浓度在0.1～1.0mg/mL范围内，其与清除率呈正相关。明日叶中黄酮类化合物对羟基自由基有较强清除效力，作为天然抗氧化产品开发具有一定价值。

关键词：明日叶；总黄酮；羟基自由基；清除率

明日叶（AngelicakeiskeiKoidzumi）原产于日本八丈岛，又名八丈草。明日叶具有强韧的生命力，今日摘明日又长出牙，因而由产地及生长特征而得名。明日叶富含黄酮类物质，具有增强免疫力、防癌抗癌、降血脂、治疗糖尿病、抗炎消炎等功效。在生命活动的氧化代谢产物中会不断产生各种含氧自由基，而自由基被认为是引起人体衰老和某些慢性疾病发生的原因之一，其中羟基自由基作用最强。黄酮类物质具有良好的抗氧化性，对羟基自由基具有明显的清除作用。本实验研究明日叶总黄酮对羟基自由基的清除能力。

1实验

1.1材料与试剂

明日叶，产自上海交通大学农业与生物学院种植实验基地；芦丁标准品，纯度＞98%，上海融禾医药科技有限公司产品；无水乙醇，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠，硫酸亚铁等，均为分析纯。

1.2仪器与设备

RT-25粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；DK-S26电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；EPPENDOF5810R离心机（上海肯强仪器有限公司）；DU800UV/Vis分光光度计（美国BeckmanCoulter公司）；旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器厂）；FD-1A-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器公司）。

1.3实验方法

1.3.1明日叶总黄酮浸提物的制备

明日叶用水洗净，置于－20℃冷冻24h，然后冷冻干燥22h，得到脱水明日叶。采用超低温液氮粉碎的方法将明日叶粉碎，并过100目筛，得到干燥粉末。按质量体积比为1∶10的比例将干燥粉与体积分数为65%的乙醇溶液混合，在45℃水浴加热15min浸提，浸提液在4℃、8000r/min条件下离心20min，取上清液置于圆底烧瓶中，在42℃、0.1MPa条件下进行旋转蒸馏去除乙醇，将剩余浸提液冷冻干燥，得到明日叶总黄酮浸提物粉末作为样品。

1.3.2明日叶总黄酮含量的测定

明日叶浸提物总黄酮含量测定采用硝酸铝―亚硝酸钠比色法，具体操作方法主要是参考文献10，得到芦丁吸光度与质量浓度的标准曲线回归方程y＝0.0068x－0.0035，R2＝0.9942。芦丁质量浓度在0～25μg/mL范围内呈现良好的线性关系。明日叶浸提物总黄酮含量测定：取0.01g样品，用体积分数65%乙醇溶解，定量转移至10mL容量瓶，配成1mg/mL待测液备用。取1mL待测液液，按标准曲线建立的方法测定吸光度，根据（1）式求出样品液总黄酮质量分数。

式中ρ为标准曲线回归方程计算出的总黄酮质量浓度（μg/mL），Va为显色反应总体积（mL），Vb为样品待测液体积（mL），1.00为显色反应加入样品溶液的体积（mL），m为样品质量（g）。

1.3.3明日叶总黄酮对羟基自由基的清除能力的测定

采用Fenton反应产生羟基自由基：H2O2＋Fe2+→OH－＋·OH＋Fe3+，水杨酸能有效捕捉羟基自由基且反应生成有色产物，其有色产物在510nm处有较强吸收峰。当在体系中加入黄酮类物质，由于黄酮具有清除羟基自由基能力，体系颜色发生变化，因此可用分光光度法测定黄酮类物质对羟基自由基的清除率。由于黄酮在510nm处有较强吸收峰，Fe2+可以与水杨酸形成有一定颜色的络合物，从而对测定水杨酸与羟基自由基反应生成的有色产物产生影响。因此以硫酸亚铁、水杨酸以及不同浓度的样液混合物为本底吸收，测定本底吸光度，在计算中扣除。

E为羟基自由基的清除率；Ai为加抗氧剂时溶液的吸光度；Aj为本底吸光度；Ac为未加抗氧剂时溶液的吸光度。

1.3.3.1Ac值的测定取2mL双蒸水，加入2mL2mmol/L的FeSO4溶液、2mL6mmol/LH2O2，静置10min，再加2mL6mmol/L的水杨酸混匀，在37℃水浴反应20min，于510nm处测其吸光度Ac。

1.3.3.2Ai值的测定

分别取2mL不同浓度的样液，各加入2mL2mmol/L的FeSO4溶液、2mL6mmol/L的H2O2溶液，静置10min后加2mL6mmol/L的水杨酸混匀，在37℃水浴反应20min，于510nm处测其吸光度Ai。

1.3.3.3Aj值的测定

分别取2mL不同浓度的样液，各加入2mL2mmol/L的FeSO4溶液、2mL6mmol/L水杨酸溶液，静置10min后加2mL双蒸水混匀，在37℃水浴反应20min，于510nm处测其吸光度为Aj。

2结果与分析

2.1明日叶总黄酮含量

表1为明日叶总黄酮质量分数的测定结果。由表1可知，明日叶提取物总黄酮的平均质量分数为（10.18±0.23）%。

2.2明日叶总黄酮对羟基自由基的清除能力

表2为明日叶总黄酮对羟基自由基清除能力的测定结果。由表2可知，提取液总黄酮质量浓度在0.1～1.0mg/mL范围内时清除率与提取液浓度呈正相关；当提取液总黄酮浓度达到1.0mg/mL时，清除率达到61.9%；当提取液总黄酮质量浓度＞1.0mg/mL时，总体趋势是清除率随着提取浓度增大而增大，但不呈正相关，原因是当提取液总黄酮浓度增大，混合样液本底吸光度会受到干扰增大，规律性就会受到一定的影响。

3结论

明日叶乙醇提取物总黄酮质量分数为10.18%。结果说明明日叶含有较高天然植物抗氧化活性物质。明日叶总黄酮对羟基自由基具有较强的清除能力，提取液总黄酮质量浓度在0.1～1.0mg/mL范围内清除率与浓度呈正相关，总黄酮质量浓度达到1.0mg/mL时，清除率为61.9%。结果表明明日叶黄酮类物质具有较强抗氧化能力，可作进一步抗氧化性研究和天然抗氧化产品的开发。