明日叶查尔酮对糖尿病大鼠肝细胞PI3K和AktmRNA表达的影响

研究地点：青岛大学医学院营养研究所，青岛

摘    要

目的

研究明日叶查尔酮(ashitabechalcone，AC)对糖尿病大鼠肝细胞磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyIinositol3-kinase，PI3K)和蛋白激酶(serine-threoninekinases，Akt)mRNA表达的影响。

方法

高脂饲料喂养加链尿佐菌素腹腔注射诱发的2型糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组和高、低剂量AC组，每组10只，均喂饲高脂饲料，分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮0、30和10mg/kgBW。另设一个正常对照组为正常大鼠喂饲普通饲料，实验周期4周。用放射免疫分析法检测血清胰岛素水平，葡萄糖氧化酶法测血糖含量，逆转录聚合酶链式反应方法检测肝细胞PI3K和AktmRNA表达水平，蛋白印迹法测肝细胞Akt磷酸化水平。

结果

高剂量AC组空腹血糖和血清胰岛素水平显著低于糖尿病对照组，而PI3KmRNA、AktmRNA和磷酸化Akt蛋白表达水平均显著高于糖尿病对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

结论

明日叶查尔酮可上调糖尿病大鼠PI3K和AktmRNA的表达水平，改善胰岛素抵抗。

 

关键词：明日叶查尔酮磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶Akt胰岛素抵抗

 

PI3K/Akt信号通路是胰岛素受体后信号转导的关键途径，是激活葡萄糖转运体，促进糖原合成和葡萄糖转运的关键效应分子。Akt磷酸化及PI3K与Akt表达降低，可导致胰岛素受体后的信号转导障碍，从而发生胰岛素抵抗。明日叶是原产于日本八丈岛的野生芹科植物，查尔酮(chalcone)是明日叶(Angelicakeiskei)的主要功效成分。

有研究报道，明日叶查尔酮(ashitabechalcone，AC)具有抗氧化、降血糖、改善胰岛素抵抗等有良好生物活性。本研究给高脂饲料喂养+链尿佐菌素所致的糖尿病大鼠口服AC，探讨了AC对糖尿病大鼠Akt磷酸化、PI3K和AktmRNA表达和胰岛素抵抗的影响。

1材料与方法

1.1实验动物和饲料

清洁级健康雄性Wistar大鼠(山东鲁抗医药实验中心提供)，6～8周龄，体重180～200g，许可证号：SCXK(鲁)2009-2007，合格证号：0013862，在本实验室适应性喂养7d后用于实验(动物房室温25℃，相对湿度50%，光照度150lx)。高脂饲料(10.0%猪油，20.0%蔗糖，2.5%胆固醇，1.0%胆酸盐，66.5%常规饲料)，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2实验样品

明日叶查尔酮由本实验室制备，经紫外分光光度法测定含量＞90%。查尔酮标准品购于美国Sigma公司。

1.3试剂和仪器

链尿佐菌素(STZ)，美国Sigma公司；血清胰岛素放射免疫测定试剂盒，天津九鼎医学生物工程有限公司；RNA抽提试剂盒，天根生化科技有限公司；兔InsR多克隆抗体，美国Neomarkers公司；SP试剂盒，迈新生物技术开发有限公司；DYY-7C型电泳仪，北京六一仪器厂；凝胶成像系统，上海韵涵生物科技有限公司；紫外分光光度计UV-2000，龙尼柯仪器有限公司；台式高速冷冻离心机TGL-16，湘仪离心机公司。

1.4造模及分组

实验动物在本实验室适应性饲养1周后，随机取10只设为正常对照组，饲以基础饲料。其余动物用高脂饲料喂养3周后，连续3d腹腔注射小剂量STZ(25mg/kg)，继续高脂饲料喂养，一周后测定空腹血糖大于11.1mmol/L为造模成功大鼠。参照血糖水平将成模大鼠随机分为糖尿病对照组和高、低剂量AC组，每组10只，均饲以高脂饲料。高、低剂量AC组分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮30、10mg/kg，正常对照组和糖尿病对照组则给予蒸馏水。实验4周后，全部动物禁食12h后，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，分离血清检测血糖和胰岛素水平，取肝组织置－80℃冷冻备检肝细胞PI3K和AktmRNA表达水平及肝细胞Akt磷酸化水平。

1.5空腹血糖和血清胰岛素水平测定

血清胰岛素水平用放射免疫分析法检测，血糖含量用葡萄糖酶氧化法测定，并根据公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)：胰岛素抵抗指数=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5。

1.6肝细胞PI3K和AktmRNA表达水平测定

取肝组织用Trizol试剂提取大鼠肝脏总RNA并测定纯度后，在逆转录酶(MLV)催化下合成cDNA，以适量cDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增。

磷脂酰肌醇3激酶基因上下游引物：

5′-AGCATCCCCTCCGTGCCCAA-3’和5′-GAAGGCGGGGGAGGGGAGAG-3’，扩增片段为333bp；

蛋白激酶B基因上下游引物：

5′-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3’和5′-TTGGCCAGGGCCACCTCCAT-3’，扩增片段为361；

GAPDH为内参照，其上下游引物：

5′-TCTCCGCCCCTTCCGCTGAT-3’和5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3’，扩增片段为291bp。

所用引物均由上海生工生物公司合成。胰岛素受体基因的扩增条件：预变性95℃，2min后，进入循环，95℃20s、59℃25s、72℃30s，45个循环后72℃延长5min。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于MUVB．20凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，以GADPH为内参照，用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1.7肝细胞磷酸化Akt蛋白表达测定

用Western-blot法检测肝细胞磷酸化Akt表达。取肝组织100mg置于离心管中，加入RIPA900μl，冰浴匀浆后立即加入PMSF100μl，转移至1.5ml离心管中加入Complete液40μl，40℃离心10000r/min，10min，取上清液紫外法测定蛋白含量后。取含30μg总蛋白的上清液进行12%SDS-PAGE电泳。停止电泳后于4×100V条件下转膜1h，然后用脱脂奶粉37℃封闭1h，充分洗膜后加相应稀释的一抗溶液(磷酸化Akt按1∶500稀释、GADPH按1∶2000稀释)4℃孵育过夜，洗膜后加入HRP酶标二抗，37℃与PVDF膜共同孵育杂交1h，洗膜后将杂交膜与感光胶片在暗室内曝光显示各蛋白条带，GAPDH蛋白表达量为内对照，用凝胶成像及分析系统分析各组蛋白显色的密度值并计算各组Akt/GAPDH值。

1.8统计处理

实验数据以x±s表示，采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，并同时进行LSD比较，以P＜0.05为具有统计学意义。

 

2结果

2.1血糖、血清胰岛素及HOMA-IR的比较

由表1可见，糖尿病对照组血糖、胰岛素水平和HOMA-IR均高于正常对照组，高剂量AC组则低于糖尿病对照组，差异均有显著性(P＜0.05)。

2.2各组PI3K和AktmRNA表达水平

由表2可见，糖尿病对照组的PI3K和AktmRNA表达水平均显著低于正常对照组(P＜0.05)。高剂量AC组的PI3K和AktmRNA表达水平均高于糖尿病对照组，差异有显著性(P＜0.05)。电泳图谱见图1。

2.3各组磷酸化Akt表达正常对照组和糖尿病对照组的Akt/GAPDH值分别为1.47±0.28和0.68±0.14。糖尿病对照组磷酸化Akt蛋白表达水平显著低于正常对照组(P＜0.05)。AC高剂量组Akt/GAPDH值为1.34±0.26，高于糖尿病对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)(图2)。

3讨论

本研究中糖尿病对照组的血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数均显著性高于正常对照组(P＜0.05)，说明成功诱发了糖尿病大鼠模型，存在胰岛素抵抗。AC高剂量组的血糖和血清胰岛素水平均低于糖尿病对照组，说明AC可降低2型糖尿病血糖水平，改善胰岛素抵抗。PI3K/Akt信号通路为胰岛素受体通路的主要下游信号通路，其中PI3K、Akt是胰岛素信号向调节葡萄糖转运方向转导的关键蛋白。PI3K是一类特异性的催化磷脂酰肌醇(PI)3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的激酶。Akt是PI3K的下游分子，主要负责由PI3K始动的生物信息的转导。磷酸化是Akt激活的主要机制，活化的Akt可促进糖原合成和葡萄糖转运，是胰岛素最终发挥效应的关键分子。

本研究结果显示，糖尿病对照组PI3KmRNA、AktmRNA与Akt磷酸化水平均显著低于正常对照组(P＜0.05)，说明存在胰岛素信号转导障碍。这与文献报道的在高脂饲料喂养的ob/ob小鼠(2型糖尿病鼠)肝细胞中PI3K表达量和活性较正常低50%以及糖尿病SD大鼠骨骼肌Akt蛋白表达和磷酸化水平均降低相一致。

分析各AC组结果显示，高剂量AC组PI3KmRNA、AktmRNA、磷酸化Akt水平明显高于糖尿病对照组(P＜0.05)，而其血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数则显著低于糖尿病对照组(P＜0.05)，并且高剂量组的改善作用显著大于低剂量组，表明AC具有上调2型糖尿病大鼠的PI3KmRNA和Akt的mRNA与磷酸化表达水平，逆转PI3K/Akt信号通路信号转导障碍，改善2型糖尿病的胰岛素抵抗作用。本结果与HIROMU等报道的结果相一致。