明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠肝细胞胰岛素受体与胰岛素受体底物-2mRNA表达的影响

科研机构：青岛大学医学院营养研究所、青岛市疾病预防控制中心

摘  要

目的：

研究明日叶查尔酮（Ashitabechalcone,AC）对糖尿病大鼠肝细胞胰岛素受体（insulinreceptor,InsR）和胰岛素受体底物-2（insulinreceptorsubstrate-2,IRS-2）mRNA表达的影响。

方法：

将用高脂饲料喂养加链尿佐菌素腹腔注射诱发的2型糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组和高、低剂量AC组，每组10只,均喂饲高脂饲料,分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮的剂量为0、30、10mg/kg。另设一个正常对照组为正常大鼠喂饲普通饲料，实验周期4周。

用放射免疫分析法检测血清胰岛素水平、逆转录聚合酶链式反应方法检测肝细胞InsR和IRS-2mRNA表达水平、免疫组化法测肝细胞InsR蛋白表达水平、葡萄糖氧化酶法测血糖含量。

结果：

与正常对照组比较，糖尿病对照组空腹血糖和血清胰岛素升高，而InsR和IRS-2mRNA表达水平降低。与糖尿病组比较，高剂量AC组空腹血糖和血清胰岛素降低，而InsR和IRS-2mRNA表达水平升高，各项差异均有显著性意义（P<0.05）。

结论：

明日叶查尔酮可上调2型糖尿病大鼠肝细胞InsR和IRS-2mRNA表达水平，改善胰岛素抵抗状况。

关键词：明日叶；查尔酮；胰岛素受体；胰岛素受体底物-2；胰岛素抵抗

正文：

明日叶(Angelicakeiskei)是原产于日本八丈岛的野生芹科植物，明日叶查尔酮(Ashitabechalcone，AC)是明日叶中主要有效成分。明日叶查尔酮有良好的抗氧化、抗糖尿病等作用。

近来研究发现，2型糖尿病胰岛素信号转导障碍是发生胰岛素抵抗的重要原因，胰岛素受体(insulinreceptor，InsR)和胰岛素受体底物-2(insulinreceptorsubstrate-2，IRS-2)是胰岛素信号传导通路中的关键分子。

为了探讨AC对胰岛素抵抗的影响及其可能的分子机制。本研究采用给2型糖尿病大鼠口服AC的方法，观察了AC对肝细胞InsR和IRS-2mRNA表达的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物和饲料

清洁级健康雄性Wista大鼠45只(山东鲁抗医药实验中心提供)，6～8w龄，体重180～200g。高脂饲料由北京华阜康生物科技公司提供。

1.1.2实验样品

明日叶查尔酮由本实验室制备，经紫外分光光度法测定含量＞90%。查尔酮标准品购于美国SIGMA公司。

1.1.3试剂和仪器

链尿佐菌素（STZ）：美国Sigma公司产品；血清胰岛素放射免疫测定试剂盒：天津九鼎医学生物工程公司提供；RNA抽提试剂盒：天根生化科技公司产品；兔InsR多克隆抗体：美国Neomarkers公司产品；SP试剂盒：迈新生物技术开发公司生产；DYY-7C型电泳仪：北京六一仪器厂生产；凝胶成像系统：上海韵涵生物科技公司产品；紫外分光光度计UV-2000：龙尼柯仪器公司；台式高速冷冻离心机TGL-16：湘仪离心机公司产品。

1.2方法

1.2.1造模及分组

动物在本实验室适应性饲养1周后，随机取10只设为正常对照组，其余用高脂饲料喂养加腹腔注射STZ诱发糖尿病，测空腹血糖大于11.1mmol/L为造模成功。参照血糖水平将成模大鼠随机分为糖尿病对照组和高、低剂量AC组，每组10只，均饲以高脂饲料。高、低剂量AC组分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮30、10mg/kg。正常对照组饲以基础饲料。实验4周后，全部动物禁食12h后，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血分离血清和取肝组织进行指标检测。

1.2.2检测指标

（1）空腹血糖、血清胰岛素水平及胰岛素抵抗指数；血清胰岛素检测：放射免疫分析法；血糖含量测定：葡萄糖酶氧化法。

胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5

（2）肝细胞InsR和IRS-2mRNA表达水平：将肝组织按Trizol试剂试剂盒说明书提取肝脏总RNA，用紫外可见分光光度仪测定其纯度和含量。在逆转录酶(MLV)催化下合成cDNA，以适量cDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增。胰岛素受体基因上下游引物序列为5′-CCGAGAGCT-GGGGCAGGGAT-3’5′-GTAGGGGGAGGACGGCCTGG-3’，扩增片段为318bp；胰岛素受体底物-2基因上下游引物为5′-GCCTTCGTGCCCACCCACTC-3’5′-AA-GGGGCTGCGCTGATGCTG-3’，扩增片段为346；GAPDH为内参照，其上下游引物为5′-TCTCCGCCCCTT-CCGCTGAT-3’5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3’，扩增片段为291bp。所用引物均由上海生工生物公司合成。胰岛素受体基因的扩增条件：预变性95℃,2min后，进入循环，95℃，20s，59℃，25s，72℃，30s，45个循环后72℃延长5min。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于MUVB.20凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，以GADPH为内参照，用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量；

（3）肝细胞InsR蛋白表达水平：用免疫组化法测定：取肝组织，经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片（3μm）；3%H2O2室温孵育10min；5%～10%正常山羊血清封闭10～15min；加入一抗，37℃孵育1～2h；滴加二抗，37℃下10min；滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素，37℃下10min；DAB显色，室温3min；苏木素复染1min；酒精脱水，中性树胶封片等处理，进行拍照和图像分析系统结果分析。

1.2.3统计处理

采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，并同时进行LSD比较，以P＜0.05为有统计学差异。

2结果

2.1血糖、血胰岛素及HOMA-IR（表1）

糖尿病对照组血糖、胰岛素水平和HOMA-IR均高于正常对照组，高剂量AC组则低于糖尿病组,差别均有显著性意义（P＜0.05）。

2.2InsR和IRS-2mRNA表达水平（表2，图1）

糖尿病对照组的InsR和IRS-2mRNA表达水平分别为0.214±0.051和0.251±0.013，均较正常对照组显著性降低（P＜0.05）。高、低剂量AC组的InsR和IRS-2mRNA表达水平均较糖尿病对照组提高，差异有显著性（P＜0.05）。

2.3肝细胞InsR蛋白的表达水平（表3，图2）

InsR蛋白为细胞膜表达，免疫组化染色后，呈现棕黄色物质为阳性。糖尿病对照组染色较对照组减弱，高剂量AC组较糖尿病组明显增强（图2）。各组图像分析的平均积分光密度值（IDP）见表3。

3讨论

2型糖尿病的主要特征是存在血糖和血清胰岛素水平都升高的胰岛素抵抗及胰腺β细胞分泌功能异常,其原因与胰岛素的受体结合及受体后信号转导异常有密切关系。胰岛素受体（InsR）与胰岛素受体底物-2（IRS-2）是肝脏胰岛素信号转导过程中关键分子。IRS-2是胰岛素受体底物（IRS）蛋白家族中的主要成员和胰岛素信号核心介子，主要在肝脏和胰岛β细胞中表达，具有促进肝糖原合成和抑制肝糖输出的代谢效应。有研究发现，敲除IRS-2的小鼠，可出现外周胰岛素抵抗和肝脏胰岛素抵抗。也有学者报道肝脏IRS-2含量增加可使胰岛素的生物学效应增强和胰岛素敏感性增强。

本研究表明，糖尿病对照组血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数均较正常对照组显著升高，而IRS-2mRNA和InsR的mRNA与蛋白表达水平则均较正常对照组显著性降低，说明成功诱发2型糖尿病大鼠模型，存在胰岛素抵抗和胰岛素信号转导障碍。胰岛素信号通路中关键分子表达降低、磷酸化水平下降都可引起胰岛素信号转导障碍。高剂量AC组IRS-2mRNA和InsR的mRNA与蛋白表达水平均较糖尿病对照组显著增高，而其血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数则均较糖尿病对照组显著降低，且呈现出高剂量组的改善作用大于低剂量组的趋势，表明AC有上调2型糖尿病大鼠的IRS-2mRNA和InsR的mRNA与蛋白表达水平，改善胰岛素受体及受体底物的信号转导，减轻2型糖尿病的胰岛素抵抗的作用。

本研究显示，明日叶查尓酮（Ashitabechalcone,AC）对2型糖尿病葡萄糖代谢的改善作用可能是通过改善胰岛素信号转导障碍，从而提高胰岛素敏感性而实现的。本研究结果与文献报道AC有降低糖尿病氧化应激和血糖水平，改善胰岛素抵抗等作用相一致，为AC及相关植物化学物的抗糖尿病作用与机制研究提供新资料和依据。