明日叶中查尔酮诱导人胃癌细胞MGC-803凋亡的研究

摘要

目的：研究不同明日叶查耳酮成分对人肝癌细胞SMMC-772l增殖的抑制作用。

方法：以人胃癌细胞株MGC-803为研究对象，通过MTT法观察不同时间点明日叶中查尔酮成分对细胞增殖的影响，经Hoechst33258和AO/EB染色，再通过荧光显微镜观察其细胞核形态变化。结果：MTT实验结果显示化合物1、2、6、7、9和10，对人肝癌细胞SMMC-7721均有较强的抑制作用，并且显示出明显的剂量依赖关系。随药物浓度的增加，细胞增殖抑制作用明显加强。

结论：明日叶中查耳酮类成分有抑制SMMC-7721细胞增殖的作用。

关键词：明日叶；查耳酮；4-羟基德里辛（4HD）；黄腐醇（XA）；MTT；细胞凋亡

本实验主要同大阪药科大学马场贵美江学术团队合作，以人胃癌细胞株MGC-803为研究对象，通过MTT法观察不同时间点明日叶中查尔酮成分对细胞增殖的影响；通过倒置显微镜观察明日叶中查尔酮成分对胃癌细胞一般的外观形态：经Hoechst33258和AO/EB染色，再通过荧光显微镜观察其细胞核形态变化：通过透视电子显微镜观察其细胞的超微结构变化，琼脂糖凝胶电泳观察细胞DNA的ladder；流式细胞术进行细胞凋亡率的测定和细胞周期分析。以期探讨明日叶中查尔酮成分在体外是否通过诱导细胞凋亡来抑制癌细胞的增殖，为其更好地运用于胃癌的治疗提供实验依据。

1材料与仪器

1.1药物与试剂

RPMll640培养基（GIBCO，美国）；新生牛血清（日本）（56℃水浴灭活0.5h）；胰酶（AMRESCO，美国）；MTT（AMRESCO，美国）；青霉素、链霉素（日本宝生公司）；0.1mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2～7.4）自制；二甲基亚砜（DMSO，AMRESCO）；其他为国产分析纯试剂。

实验所用查尔酮样品均由日本大阪药科大学实验室从明日叶中分离所得，经熔点测定、UV、1H-NMR和13C-NMR等确定结构，HPLC测定其纯度均大于99.40%。

化合物分别为：①Xanthoangelol，②4-Hydroxyderricin，③isobavachalcone，④xanthoangelolB，⑤xanthoangelolC，⑥xanthoangelolD，⑦xanthoangelolE，⑧xanthoangelolF，⑨xanthoangelolG，⑩xanthoangelolH。

1.2

细胞株及细胞培养

人胃癌细胞株MGC-803购自南京建成生物技术发展有限公司。选用含10%小牛血清的DMEM培养液。

细胞培养条件：于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱常规培养，待细胞满至80%左右时，用0.25%胰酶消化、传代。选用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，培养液中青霉素、链霉素的的浓度为100mg•L-1。

1.3主要仪器

CO2细胞培养箱（SANYON，日本）；酶标分光光度读板仪（Bio-Rad680，USA）；精密电子分析天平（BP211D，Startorius）；超净工作台（苏州净化设备厂）；OLYMPUS倒置显微镜（Japan）；WH-861型旋涡混合器（江苏省太仓市科教器材）；离心机（JingLiLDS-10B）；恒温水浴锅（华利达HS-6），96孔细胞培养板（Cosuar）等仪器。

2方法

2.1样品处理

实验所用药物查耳酮全部由大阪药科大学实验室制备，经HPLC分析，其纯度高于95%。以二甲基亚砜（DMSO）助溶，DMSO最终浓度不超过1.0%。

0.22μm微孔滤膜（GVMP01230，Millipore，USA）过滤除菌，4℃保存待用。

2.2MTT比色法

MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。取处于对数生长期的细胞，用0.5%的胰酶消化，吹打成单细胞悬液，接种于96孔板中（细胞密6×104cells/ml），每孔98μl。在细胞贴壁并生长融合至50%～70%加药处理，每种药物设5个浓度梯度（每孔加入20μl5mg/ml的MTT溶液，平面混匀后，置于培养箱中继续孵育4h，然后弃去各孔中的上清液，再加入100μLDMSO，平面振荡混匀10min，待其各孔中的紫色结晶完全溶解后，置于酶标分光光度读板仪下测定各孔中的吸光值（A，λ490nm）。按下面公式计算细胞活率：

细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%

其作用时间分别设为24h、36h、48h与72h，待药物作用时间结束，利用MTT法观察药物对细胞增殖的影响。

注：（A）（B）图中所示化合物 a、b、c、…g；分别对应化合物①、②、③…⑦。（C）图中所示化合物 h、i、j 分别对应化合物⑧、⑨、⑩（n=4）。

2.3结果

由图1、2MTT实验结果显示化合物①、②、⑥、⑦与⑨和⑩对人肝癌细胞SMMC-7721均有较强的抑制作用，并且显示出明显的剂量依赖关系。随药物浓度的增加，细胞增殖抑制作用明显加强。在高剂量20μg/mL时，药物对细胞的抑制作用分别为68.18%、66.07%、56.69%、66.69%、45.76%与62.34%。

根据以上结果，认为查尔酮化合物①、②、⑥、⑦、⑨与⑩为有效抗肿瘤成分。

注：药物作用时间分别为24h（◇），36h（■），48h（△）与 72h（▲）。

由图3可知，药物作用细胞24h、36h、48h与72h后，可明显抑制细胞增殖，并且该制作用呈一定的剂量依赖性与时间依赖性。药物在48h时的IC50值为5.98μg/ml。鉴于药物抑制细胞增殖的作用可通过抑制细胞生长或者引导细胞凋亡来实现。为此，我们将进一步研究查耳酮类化合物能引导细胞凋亡，并且初步将药物的作用时间定为48h。

3讨论

目前研究认为，肿瘤的发生和发展不仅是肿瘤细胞增殖和分化异常所致，而且还是肿瘤细胞凋亡异常的结果。因此，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，对临床治疗肿瘤有指导意义。

本实验结果表明：明日叶查耳酮在高剂量20μg/ml作用72h，SMMC-7721细胞形态变化明显，细胞存活率显著降低，提示氧化苦参碱对SMMC-7721细胞的生长有抑制作用，且这种抑制作用呈时间剂量依赖性。

但也有研究认为，查耳酮作用于SMMC-7721细胞，使细胞堆积于s期。查耳酮是否作用于细胞核DNA，通过改变DNA序列和抑制DNA的合成而抑制肿瘤细胞的生长，值得进一步探讨。