明日叶查尔酮对小鼠H22肝癌细胞增殖活性的抑制作用研究

摘要:

为研究明日叶查尔酮(AC)对小鼠H 22肝癌细胞增殖的抑制作用，采用如下方法进行实验:1)将50只荷H 22肝癌小鼠随机分为5组，每组10只。低、中、高剂量组每日分别灌胃给予5、20和40mg·kg- 1明日叶查尔酮，肿瘤对照组给予生理盐水，环磷酰胺(CTX)组隔天腹腔注射20mg·kg- 1的CTX。饲养10d后处死小鼠，测定瘤重、体重和抑瘤率，取瘤组织用免疫组化法检测肿瘤细胞PCNA和Caspase-3蛋白的表达。 2)将不同浓度AC与小鼠H 22肝癌细胞共同培养，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定肝癌细胞增殖活性。结果为:1)肿瘤对照组的瘤重、PCNA和Caspase-3的阳性表达率分别为(0.55± 0.23)g、72.77%和5%，高剂量组则分别为(0.31± 0.05)g、28.33%和38.52%。 2)肿瘤对照组和高剂量组的细胞增殖活性分别为1.135± 0.032和0.716± 0.028。两组间各项差别均有显著性意义(p< 0.05)。从以上数据可以得出结论:明日叶查尔酮对小鼠H 22肝癌细胞的增殖有抑制作用。

 

关键词：明日叶查尔酮， 肝癌， Caspase-3， PCNA

 

研究地点：

1.青岛大学医学院公共卫生学系，青岛

2.山东省烟台护士学校，烟台

 

明日叶(Ashitaba)是一种原产于日本八丈诸岛的芹科植物，岛民多食用明日叶均很长，故又名长寿草。据报道，明日叶的主要功效成分查尔酮(chalcone)具有提高机体免疫力、润肠通便、抗肿瘤和抗氧化等显著功效。邓良利等对明日叶的毒性及其致突变和致畸性进行了研究，结果显示明日叶的急性毒性为实际无毒级，致突变试验阴性，传统致畸试验中未见发育毒性。

 

国外对于明日叶的研究较多，大量学者研究证实明日叶是一种药食两用的保健食品，可杀死白血病细胞，治疗糖尿病并具有消炎杀菌的作用。由此可见，明日叶是一种绿色无毒健康的植物，发展前景广阔，具有深远的研究价值。

 

细胞增殖与凋亡的失衡是肿瘤发生发展的基础，细胞的过度增生而凋亡的减少是肿瘤生长的主要因素。目前尚未见有关于明日叶查尔酮对肿瘤细胞增殖与凋亡影响的研究报道。本实验通过给荷H 22肝癌瘤小鼠喂饲不同剂量的明日叶查尔酮(Ashitabachalcone，AC)和将H 22肝癌细胞与AC共同培养的方法，检测肿瘤重量、细胞Caspase-3和PCNA表达和肿瘤细胞增殖活性等指标，探讨了AC对H 22肝癌细胞的抑制作用。

 

1　材料与方法(Materialsandmethods)

1.1　主要材料

1.1.1　实验动物

H 22肝癌荷瘤种鼠由山东省实验动物中心提供。清洁级健康昆明种小鼠50只(雌雄各半)，由山东鲁抗医药实验中心提供，6- 8周龄，体重18- 20g。小鼠实验前于本实验室适应性喂养7d。

1.1.2　实验样品

明日叶查尔酮由本实验室制备，经紫外分光光度法测定其纯度> 90%。查尔酮标准品购于美国Sigma公司。

1.1.3　试剂与仪器

RPM 1640培养基、胎牛血清和四甲基偶氮唑蓝(MTT)(美国GIBCO公司)；环磷酰胺(10013021)(江苏恒瑞医药股份有限公司)；PCNA、Caspase-3一抗、二抗和即用型SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；5%CO2培养箱(日本三洋电器有限公司)；TDL-5离心机(上海安亭科学仪器厂)；酶标仪(瑞典产RosysAnthos双波长2010型)；倒置显微镜(日本产OlympusXDS-1B型)。

 

1.2　实验方法

1.2.1　动物实验

1.2.1.1　肿瘤接种　无菌抽取H 22肝癌小鼠腹水，镜下调节肿瘤细胞密度至1× 107mL- 1，制成细胞悬液于小鼠右前肢腋窝处皮下接种，每只0.2mL。

1.2.1.2　动物分组与处理　肿瘤细胞接种后次日，将50只小鼠随机分为肿瘤对照组、环磷酰胺组和低、中、高3个明日叶查尔酮剂量组，每组10只，雌雄各半。 3个AC剂量组分别经口灌胃给予明日叶查尔酮5、20和40mg·kg- 1，连续10d。肿瘤对照组同样方法给予生理盐水，环磷酰胺组隔日腹腔注射CTX(20mg·kg- 1)1次。于第11天颈椎脱臼处死全部小鼠，取瘤组织待检。

1.2.1.3　瘤重、体重和瘤体比　采用电子动物天平测量动物的瘤重和体重，计算瘤重/体重的比值。

1.2.1.4　瘤细胞Caspase-3和PCNA蛋白表达采用SABC免疫组化法，按检测试剂盒说明检测。将瘤组织经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，3%H2O2消除内源性过氧化物酶，微波修复抗原。按1:50

浓度滴加一抗， 4℃过夜，滴加二抗，DAB显色，脱水，透明和封片。显微镜下观察PCNA和Caspase-3蛋白的表达水平。每只动物观察500个细胞，记录其中有阳性表达的细胞数。阳性表达率=(阳性细胞数/计数细胞总数)× 100%

 

1.3　体外瘤细胞增殖活性测定

取H 22小鼠肝癌组织剪碎研磨，经过滤和离心后制成瘤细胞悬液。调节细胞密度为1× 106mL- 1，接种于96孔培养板，每孔100μL。高、中和低剂量组的AC终浓度依次为5、25和50mg·L- 1，肿瘤对照组只加等体积缓冲液，CTX组加入CTX 20mg·

L- 1。置于5%CO2培养箱中37℃培养16h，用MTT法测定各孔吸光度。各组肿瘤细胞增殖活性用平均吸光度(A值)表示，并按公式:抑制率=(肿瘤对照组A值-实验组A值)/肿瘤对照组A值× 100%计算各AC组对小鼠肝癌细胞增殖活性的抑制率。

1.4　统计分析

采用SPSS 17.0统计软件，计数资料做x2检验，计量资料做单因素方差分析。

 

2　结果(Results)

2.1　瘤重、体重和瘤体比

正常对照组未见肿瘤发生。肿瘤对照组及高剂量组的平均瘤重分别为(0.55± 0.23)g和(0.31± 0.05)g，差异具有统计学意义(p< 0.05)。其他各组结果见表1。

 

2.2　Caspase-3和PCNA蛋白表达

Caspase-3阳性表达细胞的胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒。本实验肿瘤对照组阳性表达的细胞数少且颜色浅淡，呈弱表达(图1A)。AC高剂量组Caspase-3阳性表达细胞数多且颜色较深，呈强表达(图1B)。两组阳性细胞表达率分别为5%和38.52%，差异具有显著性(p< 0.05)。

PCNA为胞核表达，呈棕黄色或褐色颗粒。本实验肿瘤对照组PCNA阳性表达的细胞多，染色深(图2A)。AC高剂量组较肿瘤对照组的阳性表达细胞数少，染色浅(图2B)。

两组阳性细胞表达率分别为26.11%和35.76%，差异具有显著性(p < 0. 05)。各组Caspase-3及PCNA表达结果见表2。

 

2.3　肿瘤细胞增殖活性

高、中剂量AC组肿瘤细胞增殖活性分别为0.716± 0.028和0.834± 0.027，均较肿瘤对照组显著性降低(p< 0.05)。各组细胞增殖活性测定结果见表3。

 

3　讨论(Discussion)

明日叶查尔酮属黄酮类化合物，是明日叶的主要功效成分，其化学结构为1，3-二苯基丙烯酮，是植物体内合成黄酮的前体，以它为母体的天然化合物广泛存在于植物界中。有研究证明，从甘草中提取的查尔酮具有抗肿瘤和抗氧化等功效[8-10]，因此本实验探讨了从明日叶中提取的查尔酮对小鼠H 22肝癌细胞增殖的抑制作用，为明日叶在癌症治疗方面的应用提供理论依据。

Caspase全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶，是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包含半胱氨酸残基，能够特异性地切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，从而造成细胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中重要的公共凋亡效应因子，其活化在细胞凋亡信号转导过程中起核心作用，是细胞凋亡过程中激活的关键蛋白激酶和主要效应因子[11]。大多数触发细胞凋亡的因素，均需通过Caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡[12]。当Caspase-3表达增多时，细胞凋亡加速。本实验结果显示，高、中剂量AC组瘤细胞Caspase-3的阳性表达率高于肿瘤对照组，这说明AC具有引发肿瘤细胞Caspase-3蛋白表达，促进瘤细胞凋亡的作用。该结果与文献中报道的查尔酮具有抗肿瘤作用的结论一致[8]。

增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA多聚酶delta的辅助蛋白，其合成、表达与细胞的增殖密切相关，是反映细胞增殖水平的重要指标[13]。当细胞的增殖活性升高时，PCNA表达增强，PCNA增殖指数升高，PCNA表达减弱，PCNA增殖指数降低，表示细胞增殖活性降低[14]。本实验结果显示，高、中剂量查尔酮组PCNA蛋白阳性表达率较肿瘤对照组显著降低，且高剂量组低于中剂量组，这表明查尔酮具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

细胞增殖活性是反映细胞生理状态的基础性指标[15]。MTT法是检测细胞增殖活性最常用的方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原外源性MTT为水不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，结晶生成量与细胞的代谢活性密切相关[16-17]。当细胞受损或死亡时，该反应降低或消失，说明细胞增殖活性下降。本实验结果显示，中、高剂量AC组肿瘤细胞增殖活性明显低于肿瘤对照组，这说明AC对H 22肝癌细胞增殖有一定抑制作用。本项结果也与上述Caspase-3和PCNA的测定结果吻合。

综合本次实验结果可以认为，明日叶查耳酮能降低小鼠H 22肝癌细胞的增殖活性和PCNA蛋白表达水平，使Casepase-3蛋白表达增强，对小鼠H 22肝癌细胞增殖活性具有一定抑制作用。