明日叶查尔酮对小鼠急性辐射损伤防护作用的研究

研究地点：1. 青岛大学医学院公共卫生学院，山东青岛； 2. 青岛市市立医院，山东青岛

摘   要

目的

研究明日叶查尔酮对小鼠急性辐射损伤的防护作用。

方法

将50 只昆明种小鼠随机分5 组，每组10 只。低、中和高剂量组每天灌胃给予明日叶查尔酮4、20 和40 mg /kg，辐射损伤组与正常对照组给予生理盐水，连续5 d，

第6 天给予一次性X 射线全身照射4Gy，空白对照组不照射。照射后按前述方法继续灌胃5 d 处死动物，检测体重、骨髓嗜多染红细胞微核率，脾淋巴细胞增值活性与肝细胞凋亡等指标。

结果

与正常对照组比较，辐射损伤组的体重、淋巴细胞增殖活性和Bcl-2 /Bax 值降低，而高剂量组则较辐射损伤组升高； 辐射损伤组的微核率高于正常对照组和高剂量组。上述各组的差异均有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。

结论

明日叶查尔酮对小鼠X 射线所致辐射损伤有一定防护作用。

【关键词】明日叶查尔酮； 微核； 细胞增殖； 细胞凋亡； Bcl-2 /Bax

 

明日叶( Angelica keiskei Koidzumi，又名八丈芹、滨海当归) 是一种多年生芹科植物，其主要效应成分为查尔酮( chalcone) ^［1］。查尔酮是植物体内合成黄酮的前体物质，其基本骨架结构为1，3-二苯基丙烯酮。

有研究证明，明日叶查尔酮具有抗肿瘤、提高机体免疫力、抗氧化、清除自由基等多种生物学活性^［2］。本实验采用给辐射损伤小鼠经口灌胃给与明日叶查尔酮的方法，测定实验动物体重，骨髓嗜多染红细胞微核率，细胞增殖与凋亡等指标，对明日叶查尔酮的抗辐射损伤作用进行了实验研究。

 

1. 材料与方法

1. 1 实验动物

清洁级健康昆明种小鼠50 只，雌雄各半，体重22 ～ 25 g，由山东鲁抗医药实验中心提供，许可证号: SCXK( 鲁) 20080002，在本实验室适应性喂养1 周后进行实验。

1. 2 主要仪器

美国Varian 公司生产的2100 C 型6MV 直线加速器X 射线源； 瑞典产Ｒosys Anthos 2010型双波长酶标仪； Q-911 全自动放免仪，中国科技大学实业总公司； XDS-1B 型倒置显微镜、DP72 型图像采集设备，日本Olympus 公司。

1. 3 主要试剂

ＲPM1640 培养基、胎牛血清、小牛血清、四甲基偶氮唑蓝( MTT) 均购自美国Gibco 公司；Giemsa 染液购自于南京建成生物工程研究所； Bcl-2和Bax 一抗、二抗和即用型SABC 免疫组化试剂盒均购自于武汉博士德生物工程有限公司。

1. 4 动物分组与处理

将50 只昆明种小鼠随机分为正常对照组、辐射损伤组、明日叶查尔酮( AC) 低、中、高剂量组共5 组，每组10 只，雌雄各半。低、中、高剂量组每日经口灌胃给予剂量为每日4、20 和40 mg /kg·BW 明日叶查尔酮，正常对照组与辐射损伤组给予生理盐水，连续5 d。在第6 天实验动物进行X射线一次性全身照射，照射距离为1. 1 m，辐射剂量为4 Gy，正常对照组不照射。各组小鼠均按前述方法分别给予明日叶查尔酮和生理盐水5 d，第6 天脱臼处死，取组织待检。

1. 5 检测指标

1. 5. 1 小鼠体重:

各组小鼠在实验第1 天、辐照前1 d、辐照后1 d 和辐照后第6 天的早晨各称重1 次。

1. 5. 2 骨髓嗜多染红细胞微核率:

取股骨用2 ml 小牛血清将骨髓冲洗至离心管中，1 000 r /min 离心，按常规方法弃上清液、制备细胞悬液、制片、固定、染色和显微镜观察。每只动物观察1 000 个骨髓嗜多染红细胞，记录其中的微核细胞数并计算微核率。

1. 5. 3 脾淋巴细胞增值活性:

将无菌取出的脾脏经研磨、过滤、离心等处理后，用含10% 胎牛血清的1640培养基制成脾淋巴细胞悬液，调细胞密度至1 × 106个/ml，接种于96 孔板，每孔0. 1 ml，每只动物设5 个平行孔。37 ℃、5% CO2培养箱培养20 h，每孔加入5 mg /ml的MTT 20 μl，继续培养4 h 弃去培养液，加入二甲基亚砜( DMSO) 后避光震荡2 min，用酶标仪在492 nm 波长下检测溶液的吸光度( A) ，各组细胞增殖活性用平均吸光值表示。

1. 5. 4 肝组织Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白表达水平:

免疫组化法测定，取肝脏经固定、脱水、透明处理、包埋后制成组织切片，将切片进行脱蜡和水化、灭活内源性酶、热修复和封闭处理后滴加一抗和二抗，DAB 显色，再经苏木素复染，在高倍镜视野( × 400) 下观和拍照，用Image-Pro Plus 图像分析软件进行光密度分析。

1. 6 统计学方法

采用SPSS 17. 0 统计软件，计量资料做单因素方差分析，以P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。

 

2 结果

2. 1 小鼠体重

照射后第1 天和第6 天，辐射损伤组的小鼠体重均较正常对照组显著性降低( P ＜ 0. 05) ，中、高剂量组则较辐射损伤组显著性增高( P ＜ 0. 05) ，各组实验结果见表1。

表1 不同照射时间各组小鼠体重的测定结果( x平均 ± s )
组别	实验第1 天	辐射前1 天	辐射后1 天	辐射后6 天
正常对照组	21. 058 ± 1. 901	24. 295 ± 1. 089	24. 361 ± 1. 358	26. 93 ± 0. 857
辐射损伤组	21. 160 ± 1. 876	24. 440 ± 0. 655	22. 883 ± 1. 252ab	22. 778 ± 0. 829ab
低剂量组	22. 640 ± 2. 403	24. 155 ± 1. 179	23. 323 ± 1. 272	24. 178 ± 0. 807
中剂量组	21. 801 ± 2. 334	24. 330 ± 1. 332	24. 396 ± 1. 388	24. 792 ± 0. 919
高剂量组	21. 801 ± 1. 334	24. 382 ± 0. 989	24. 375 ± 1. 247	25. 578 ± 0. 916
注: 与正常对照组相比较，a P ＜0. 05； 与中、高剂量组比较，b P ＜0. 05； n =10。

 

2. 2 骨髓嗜多染红细胞( PCE) 微核率

辐射损伤组微核率高于正常对照组，高剂量组则较辐射损伤组降低，差异均有统计学意义( P ＜ 0. 05 ) ，各组结果见表2。

表2 各组小鼠微核率和脾淋巴细胞增殖活性的实验结果( x平均 ± s)
组别	微核率	增值活性
正常对照组	3. 534 ± 0. 179	0. 534 ± 0. 179
辐射损伤组	18. 912 ± 0. 525ab	0. 179 ± 0. 025ab
低剂量组	18. 792 ± 0. 288b	0. 179 ± 0. 028b
中剂量组	13. 638 ± 0. 644	0. 358 ± 0. 144
高剂量组	8. 667 ± 0. 543	0. 607 ± 0. 031
注: 与正常对照组相比较，a P ＜ 0. 05； 与高剂量组比较，b P ＜ 0. 05； n = 10。

 

2. 3 脾淋巴细胞增值活性

正常对照组和辐射损伤组脾淋巴细胞增值活性分别为0. 534 ± 0. 179 和0. 179± 0. 025，二者差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。高剂量组较辐射损伤组显著性升高( P ＜ 0. 05) ，各组结果见表2。

2. 4 肝细胞Bax 和Bcl-2 蛋白

Bcl-2 和Bax 阳性表达在胞浆内为橙黄色颗粒，染色越深表示表达越强。与辐射损伤组比较，高剂量组的Bcl-2 阳性表达的细胞多、染色深，呈强表达； Bax 则阳性表达的细胞少、染色浅，呈弱表达( 图1) 。图像分析结果显示，高剂量组Bcl-2 为76. 975 ± 1. 847，较辐射损伤组显著性升高( P ＜ 0. 05) ； Bax 为48. 782 ± 0. 929，较辐射损伤组显著性降低( P ＜ 0. 05) ，各组Bcl-2 和Bax 蛋白，以及Bcl-2 /Bax 结果见表3。

 

表3 各组Bax 蛋和Bcl-2 蛋白及Bcl-2/Bax 比值实验结果( x平均 ± s)
组别	Bax	Bcl-2	Bcl-2 /Bax比值
正常对照组	41. 295 ± 1. 089	82. 361 ± 1. 958	1. 993 ± 0. 057
辐射损伤组	72. 440 ± 0. 455ab	56. 383 ± 2. 282ab	0. 778 ± 0. 029ab
低剂量组	69. 155 ± 1. 979b	60. 723 ± 1. 672b	0. 878 ± 0. 007b
中剂量组	61. 430 ± 1. 332	67. 096 ± 1. 588	1. 092 ± 0. 019
高剂量组	48. 782 ± 0. 929	76. 975 ± 1. 847	1. 578 ± 0. 016
注: 与正常对照组相比较，a P ＜ 0. 05； 与高剂量组比较，b P ＜ 0. 05； n = 10。

 

3 讨论

随着科技的发展和具有放射性物质的应用，人类接触各种电磁辐射的机会增加，受到辐射损伤的危险性也随之增加。X 射线属电磁辐射中的电离辐射，通过水在辐解反应中产生的自由基引起机体损伤^［3］，对电离辐射较为敏感的器官大多为骨髓、肝脏、脾脏等DNA 合成旺盛的组织器官，受到辐射后可诱发DNA、染色体等生物大分子损伤。因此对辐射的防护已经成为关注的焦点。

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验是检测染色体损伤的一种有效方法^［4］。骨髓对辐照较为敏感，骨髓细胞受到辐射损伤可导致纺锤丝受损，在有丝分裂时被留在胞质内的染色体断片形成微核( micronuclei)^［5］，微核率的高低反映了辐射对机体损伤的程度。

本实验结果证明，辐射损伤组骨髓嗜多染红细胞微核率较正常对照组升高，中、高剂量组均较辐射损伤组显著性降低，说明明日叶查尔酮对X 射线诱发的骨髓嗜多染红细胞微核的升高有一定的抑制作用。细胞增殖活性水平是反映细胞生命力强弱的一个重要指标^［6］。MTT 法是检测细胞增殖活性常用的方法^［7］。

本实验结果显示，与正常对照组比较，辐射损伤组细胞增殖活性降低，3 个剂量组较辐射损伤组均较辐射损伤组升高，并且存在剂量－ 反应关系，提示明日叶查尔酮对X 射线引起的脾淋巴细胞增殖活性的损伤有一定的防护作用。Bcl-2 基因家族及其相关蛋白bcl-2 是目前颇受重视的调控细胞凋亡的基因^［8］。Bcl-2 蛋白高表达可抑制细胞凋亡，Bax 蛋白过表达可使细胞趋于凋亡^［9］。两者的比值决定了细胞对凋亡信号敏感性，Bcl-2 /Bax升高呈现出抑制细胞凋亡作用^［10］。

本实验结果可见，辐射损伤组Bcl-2 /Bax 比值较正常对照组降低，3个剂量组较辐射损伤组均较辐射损伤组升高，并存在随明日叶查尔酮剂量增加Bcl-2 /Bax 比值逐渐升高的剂量－ 反应关系，说明明日叶查尔酮对X 射线引起的细胞凋亡水平升高有一定抑制作用。本项结果与上述细胞增殖活性和骨髓嗜多染红细胞微核的实验结果相吻合，也与文献报道明日叶查尔酮具有抗氧化清除自由基的结果相一致^［11］。

本次实验的小鼠体重结果显示，照射后第1 天和第6 天，辐射损伤组小鼠体重均较正常对照组显著性降低，而中、高剂量组则高于辐射损伤组，表明明日叶查尔酮对X 射线诱发的小树体重降低有一定的防护作用。

总之，本次实验结果表明明日叶查尔酮可抑制X射线引起的小鼠体重下降、骨髓嗜多染红细胞微核率升高、脾淋巴细胞增殖活性降低和肝细胞凋亡水平增加，提示明日叶查尔酮对电离辐射引起的急性辐射损伤有一定的防护作用。

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